在纽约地下管道工作的水管工马力欧和路易吉，因一次意外被吸入神秘管道，坠入一个色彩斑斓的奇幻世界——蘑菇王国。这里由碧姬公主统治，却正遭受邪恶的酷霸王的恐怖威胁。酷霸王用强大的魔法冰封了企鹅冰雪王国，并企图强迫碧姬公主嫁给他，以夺取整个王国的统治权。初来乍到的马力欧兄弟被守卫误认为入侵者，幸得碧姬公主信任，与他们结盟。为阻止酷霸王的阴谋，三人踏上穿越丛林、沙漠和冰雪世界的冒险旅程。途中，马力欧凭借吃蘑菇变大、顶砖块等游戏技能屡次化险为夷，而路易吉则在胆怯中逐渐成长。他们结识了奇诺比奥等蘑菇王国居民，也遭遇了酷霸王军团的层层追击。最终决战中，马力欧借助无敌星的力量，与酷霸王展开激烈对决。兄弟二人配合默契，利用管道和道具巧妙反击，终于击败酷霸王，解救了企鹅王国和蘑菇王国。碧姬公主为感谢他们，将兄弟俩送回纽约。经此一役，马力欧和路易吉不仅成为拯救世界的英雄，更收获了真正的勇气与兄弟情谊，而蘑菇王国也恢复了往日的和平与欢乐。